2023年11月，東南大學生命科學與技術(shù)學院柴人杰教授團隊聯(lián)合上?？萍即髮W鐘桂生團隊共同在《Molecular Therapy》（IF=12.4）在線發(fā)表題為“Critical role of TPRN rings in the stereocilia for hearing”的研究論文。此研究發(fā)現(xiàn)遺傳性耳聾致病蛋白TPRN在靜纖毛根部的錐形區(qū)域形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，環(huán)狀TPRN的維持與TPRN的表達量相關(guān)，其表達過多或過少均導致環(huán)狀結(jié)構(gòu)的破壞，從而導致聽力損傷。為獲得適量的TPRN重新表達，研究人員利用錘頭狀核酶（Hammerhead ribozymes，HHR）結(jié)合廣譜啟動子去控制AAV遞送的TPRN表達量，實現(xiàn)了體內(nèi)TPRN的適量表達，恢復了Tprn敲除鼠毛細胞里的TPRN環(huán)狀結(jié)構(gòu)，最終恢復了耳聾模型小鼠的聽力。該研究詳細解析了Tprn的致聾機制，并為臨床應用AAV介導的基因治療預防和治療TPRN突變引起的DFNB79提供了一種潛在治療方法。東南大學柴人杰教授、上?？萍即髮W鐘桂生研究員為本文的共同通訊作者。東南大學至善博士后齊潔玉、副研究員談方志、博士后張李燕為本文的共同第一作者。論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.11.011
世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最新聽力報告指出，目前全球超過4.3億人患有聽力損失，到2025年聽障人士可能增加至7億。遺傳物質(zhì)突變是導致先天性耳聾的主要病因之一，超過150個基因的突變與人類非綜合征性耳聾的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前，臨床上治療耳聾的方法主要局限于助聽器和人工耳蝸，還沒有針對人類遺傳性聽力損失的生物治療方法。
東南大學柴人杰教授團隊長期致力于理解聽力相關(guān)骨架蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。前期，與上?？萍即髮W鐘桂生組利用超分辨率顯微技術(shù)發(fā)現(xiàn)了血影蛋白Spectrin（Sci Adv. 2019）以及肌動蛋白F-actin（Cell Discov. 2019）在聽力毛細胞表皮板中的規(guī)律性超微結(jié)構(gòu)，并揭示了該結(jié)構(gòu)對聽力發(fā)育的關(guān)鍵作用。毛細胞表面的纖毛能感知聲波震動，其內(nèi)的骨架蛋白是否也有規(guī)律性結(jié)構(gòu)，以及這些骨架結(jié)構(gòu)對于聽力功能和耳聾基因治療的意義尚未有深入研究。內(nèi)耳毛細胞（hair cells，HCs）是聽覺上皮組織中的聲音感受器。毛細胞通過其表面的靜纖毛感知并轉(zhuǎn)導聲音信號。靜纖毛主要包含平行的肌動蛋白纖維束，其在肌動蛋白相關(guān)蛋白的作用下交聯(lián)排列。靜纖毛直徑在與毛細胞胞體的連接處迅速變窄，該區(qū)域稱為錐形區(qū)域（taper region），為靜纖毛挺立提供剛性支持。TPRN因其定位于錐形區(qū)域而得名。TPRN由耳聾基因Tprn編碼，Tprn的突變導致小鼠和人類遺傳性聽力損失，但潛在分子機制尚未被闡明。
研究人員使用受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)（stimulated emission depletion microscopy，STED），發(fā)現(xiàn)TPRN在靜纖毛根部的錐形區(qū)域形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在與之存在相互作用的CLIC5和PTPRQ的作用下保持穩(wěn)定，三者形成的復合物可能排列成同心圓環(huán)結(jié)構(gòu)。進一步，研究人員通過肽段競爭性結(jié)合、Tprn過表達和Tprn敲除試驗破壞TPRN環(huán)狀結(jié)構(gòu)會導致嚴重的靜纖毛退化和聽力損失。首先，通過破壞TPRN和CLIC5的相互作用，引發(fā)環(huán)狀TPRN解體，會造成靜纖毛的缺失或融合，小鼠聽力受損嚴重。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)Tprn具有劑量效應。Tprn過表達的毛細胞中，TPRN表達定位改變，環(huán)狀TPRN也被解體，小鼠的靜纖毛出現(xiàn)更為嚴重的損傷；而在Tprn敲除小鼠中，小鼠的靜纖毛也出現(xiàn)較為嚴重的損傷。因此，研究人員認為Tprn的表達量對于環(huán)狀結(jié)構(gòu)和聽力的維持至關(guān)重要。
因此，研究人員在利用靶向毛細胞的腺相關(guān)病毒AAV進行的Tprn基因治療研究設(shè)計中，使用了改良的I型錘頭狀核酶（Hammerhead ribozymes，HHR）（Nat Biotechnol. 2020. PMID: 31873216），以達到恢復聽力功能的目的。錘頭狀核酶HHR是一種能夠催化RNA剪切反應的功能核酸大分子，可在特定的位置對底物RNA進行剪切，降低轉(zhuǎn)錄活性。該研究結(jié)果表明HHR的變體N107v1遞送的外源Tprn可以在Tprn缺陷小鼠中再現(xiàn)環(huán)狀TPRN結(jié)構(gòu)并有效恢復受損的聽力。
綜上所述，該研究確定了TPRN在維持耳蝸結(jié)構(gòu)和聽力功能中的作用：使用超分辨率成像方法表征了TPRN-CLIC5-PTPRQ在靜纖毛中的組織和模式，并發(fā)現(xiàn)環(huán)狀TPRN的空間組織在聽力功能中以劑量依賴的模式起關(guān)鍵作用。TPRN環(huán)的破壞會導致聽力受損，反之AAV介導的環(huán)狀TPRN恢復可以部分挽救聽力受損。該研究為AAV介導的基因治療提供了新的角度，提示某些遺傳性疾病的治療需要特別關(guān)注治療劑量以規(guī)避毒性效應。
該研究得到國家自然科學基金、國家重點研發(fā)計劃、中國博士后創(chuàng)新人才支持計劃等多個基金的資助。(齊潔玉、談方志)
